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      新一代親和純化配基-Nanobody

      最近幾年納米抗體在國內外非?;馃?,相信很多小伙伴都在從事納米抗體制藥,分子體內非侵入式分子成像,體外診斷等相關研究。我將給大家分享納米抗體的又一應用---新一代純化配基。親和純化或親和層析(Affinity Chromatography,AC)是利用偶聯親和配基的親和吸附介質為固定相親和吸附目標產物,使目標產物得到分離純化的液相層析法。親和層析已經廣泛應用于生物分子的分離和純化,如結合蛋白、酶、抑制劑、抗原、抗體、激素、激素受體、糖蛋白、核酸及多糖類等;也可以用于分離細胞、細胞器、病毒等??梢哉f親和層析技術是目前分離純化藥物蛋白等生物大分子最重要的方法之一,也是最方便簡單的方法。


      納米抗體作為親和配基有哪些優勢呢?


      1.高特異性

      理論上納米抗體能夠識別幾乎所有靶標,因此可以制備針對每種蛋白的配基,對于純化沒有親和標簽的重組蛋白或者天然蛋白來說,這將大大降低純化難度和成本,提高純化得率。雖然傳統抗體也能作為純化配基,但是純化時輕鏈易脫落導致二次污染。其次能用來純化不同亞型的蛋白,如利用納米抗體制備分識別乙肝表面抗原ad與ay的納米抗體,來分離純化ad與ay;純化HCG的α鏈與β鏈


      2.高親和力

      納米抗體雖然是單域抗體,但是其親和力與Fab,ScFV相比沒有差別,親和力可達到nM~pM級。


      3.結構穩定

      因納米抗體除了常見的FR1與FR3之間的二硫鍵外,CDR1或FR2與CDR3還有一對二硫鍵,因此其結構比較穩定,能夠容忍高離子強度,有機溶劑,低pH值和高溫。如有些抗原是脂溶性化合物,在純化這類抗原時就需要配基能夠容忍一定的有機溶劑,如利用納米抗體制備黃曲霉毒素B1(AFB1),赭曲霉毒素(OTA)免疫親和柱等。


      4.多種結構形式

      納米抗體是通過基因工程的方法篩選得到的,因此可以知道其蛋白序列,這方便了抗體的改造,可以將抗體改造為雙價,三價等,同時也能與多種融合蛋白一起融合表達,來達到實驗的目的。


      5.高載量

      納米抗體分子量小,能夠在介質表面修飾時達到很高的比表面,提高了其載量。


      新一代親和純化配基的篩選


      納米抗體主要來源于駝源和軟骨魚,通過免疫構建文庫或者直接從天然文庫中篩選binder的技術已經非常成熟了,在此就不在贅述了。對一些pH值敏感的蛋白來說,篩選過程就顯得特別重要了,如何控制篩選流程來獲得能在溫和條件下洗脫蛋白的binder,就需要研究者去探究了。其次還要去平衡親和力與洗脫條件的關系。




      應用舉例


      1. 抗體的純化


      商品化的抗體多采用protein A來純化,但是protein A卻有很強的情況依賴,如不能用來純化IgG3;原料中的蛋白酶降解,導致protein A 脫落,引發免疫原性,引發抗體聚集;不能夠容忍高鹽離子強度等。Bio Affinity Company (Naarden, The Netherlands)利用納米抗體開發了一系列親和純化填料- CaptureSelect? ligands,與protein A 相比,該配基能在堿性條件下非常穩定且洗脫條件溫和,根據抗體結構開發了一系列針對抗體恒定區的親和純化填料如CH1,CL,Fc,用來純化不同條件下的抗體,如利用針對CH1 or CL區域的納米抗體純化Fab。該公司已經被ThermoFisher收購。



      2.腺相關病毒純化


      在AVV產品中,殘留的宿主細胞蛋白,牛血清蛋白,核酸酶或者核酸等雜質,不但會影響轉染效果而且會引起免疫反應,為了得到較高純度產品,經常需要將超速離心法,液相色譜法,化學試劑法和超濾法聯合應用。但是這些方法往往步驟繁瑣,成本高,得率低。POROS? CaptureSelect? AAV8 and AAV9 Resins 是基于納米抗體的純化介質,用來一步純化獲得高純度的AAV8與AAV9。理論上可以針對AVV1,2,4,5,8,9等不同血清型載體,制備親和純化載體。


      3.科研用Nano-traps


      Nano-traps是德國chromotek公司推出的以駝源VHH為配基的親和純化介質,VHH 嬌小 的個體 (直徑 2.5 nm×高度 4 nm),使其能夠以高密度牢固地結合于固相載體捕捉微量抗原,是傳統抗體所不能比擬的。通過將VHH偶聯到magic beads 與 agarose beads上,One step一步法完成IP /Co-IP /ChIP,讓您的免疫沉淀更簡易,更便捷,更可靠,更專業,無傳統抗體的輕鏈和重鏈干擾。該產品具有:


      √極端穩定

      √70℃仍保持穩定,functionalin 2M NaCl or 0.5% SDS

      √解離常數范圍在nM內

      √高特異性

      √縮短孵化時間(只需5-30min)

      √從細胞提取物或細胞器中定量分離融合蛋白及結合因子

      √超低的非特異性結合影響

      √無污染的普通抗體的輕鏈與重鏈


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