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納米抗體開發時“草泥馬”的選擇
隨著納米抗體在抗體藥與細胞治療上的火熱，很多伙伴都在從事納米抗體研發相關工作，從文獻中我們常見到三種動物即：駱駝（Camel），羊駝（Alpaca），美洲駝(llama)，因此就有很多朋友納悶三種動物我們應該如何選擇呢？它們在抗體序列上有什么區別呢？本文給大家詳細的介紹：
駱駝，羊駝，美洲駝都屬于駱駝科，駱駝科Camelidae僅3屬6種，分布于亞洲和非洲（駱駝族Camelini）以及南美洲（羊駝族Lamini），駱駝族是從北美洲進入亞洲和非洲的一支的后代，體型大，有駝峰，適應沙漠生活，現存有2～3種，即單峰駝Camelus dromedarius，雙峰駝Camelus bactrianus和野駱駝Camelus ferus：單峰駝分布于中東和北非，駝峰1個，現存僅有家畜，野生的早已滅絕，但是有些再次被野化，如引入澳大利亞的單峰駝現在在澳洲沙漠中形成了一定規模的野生種群；雙峰駝和野駱駝分別指家畜和野生的雙峰駝，駝峰2個，分布于亞洲中部，后者駝峰較小，毛較短，四肢則較長，數量非常稀少。羊駝族是從北美洲進入南美洲的一支的后代，體型較小，無駝峰，分布于安第斯山區和南美洲南部的草原、半荒漠地區，其中家羊駝Lama glama和小羊駝Lama pacos為家畜，色系品種較豐富。
“草泥馬”分類
“草泥馬”至少在創建之初是只針對羊駝君的，但是其他幾種美洲駝長相與羊駝君類似，所以不幸躺槍。這些躺槍的呆貨們包括原駝、大羊駝和小羊駝。所謂美洲駝，指的是駱駝科三屬六種中分布于美洲的兩屬四種，駱駝科的分類形式如下：
駱駝屬（camelus）
雙峰駝Camelus bactrianus
單峰駝Camelus dromedarius
羊駝屬（Lama）
大羊駝（美洲駝）Lama glama=Llama
原駝Lama guanicoe
小羊駝屬（Vicugna）
駱馬Vicugna vicugna
羊駝（小羊駝）Vicugna pacos=Alpaca=Lama pacos
駱駝是最好區分的，羊駝與美洲駝最大的區別在于個體大小，羊駝一般成年提供能達到60Kg，而美洲駝可以達到約127-204千克， llama 腿毛比較少，耳朵呈香蕉形彎曲且比較大，臉上毛比較短。而alpaca腿毛比較厚實，耳朵直立比較大且短，臉上毛與身體一樣比較厚。
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羊駝（Alapca） | 美洲駝（llama） |
“草泥馬”體內單域抗體含量
三種動物中以駱駝體內單域抗體含量最高，約70%，而羊駝與美洲駝體內單域抗體的含量約25%~45%之間，我們可以從擴增VHH 片段的PCR的結果可以很明顯的看到，也反應了駱駝可以更容易篩選到納米抗體。
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Camel | Alpaca | llama |
以上數據來源于NBbiolab的Large VHH Na?ve libraries數據
“草泥馬”抗體分類
駱駝科體內既有常規抗體IgG1（兩種重鏈，兩條輕鏈），還有單域重鏈抗體，其結構只有重鏈且恒定區缺失CH1。
根據鉸鏈區的不同我們可以將駱駝科的抗體分為如下亞型：
其中IgG2與IgG3 屬于單域重鏈抗體，三種動物體內抗體亞型分別如下，
Alpaca：IgG1a，IgG1b，IgG2b，IgG2C
Llama：IgG1a，IgG1b，IgG2b，IgG2C
Camel：IgG1a，IgG1b，IgG2a，IgG2c，IgG3
單域重鏈抗體Germline 數據
IMGT數據庫我們可以知道
Camel
IGHV3S1 to IGHV3S41, is conventional tetrameric IgG1. IGHV3S42 to IGHV3S74, is single domain heavy chain antibody，共計33條
Alpaca
IGHV3-3 and IGHV3S53 to IGHV3S68 is single domain heavy chain antibody，共計，共計17條
Llama
IGHV3S1 to IGHV3S5 is single domain heavy chain antibody，共計5條
從Germline 數據我們可以知道Camel 抗體具有更高的多樣性。
特征氨基酸
傳統抗體的FR2中，V42、G49，L50和W52這4個氨基酸殘基參與VL的相互作用，而VHH 這四個位置發生了突變，突變如下表：
Camel VHH FR2-amino acid positions
FR2-amino acid positions | 42 | 49 | 50 | 52 |
IGHV3S42 to IGHV3S74 | F,Y,A,N,G | E,Q,G,L,T,A | C,R,M,P | F,G,L,W,Y,S,R,A,P,M,V |
Alpaca VHH FR2-amino acid positions
FR2-amino acid positions | 42 | 49 | 50 | 52 |
IGHV3S42 to IGHV3S74 | F,Y,L,V | E,Q,G,E,P,D,S,K | R,Q,L,H | F,G,L,W,M,Q,Y |
Llama FR2-amino acid positions
FR2-amino acid positions | 42 | 49 | 50 | 52 |
IGHV3S1 to IGHV3S5 | F,Y,W,M,V,L | E,A,D,G,Q,V | R,L | G,F,L,W,A,V |
以上數據統計來源于NBbiolab的Large VHH Na?ve libraries NGS數據
分子內二硫鍵位置與豐度
VHH除了正常的23位與104位形成二硫鍵外，常常在CDR1或FR2與CDR3之間形成額外的一對二硫鍵，這對二硫鍵起到穩定抗體結構的作用，雖然能夠讓抗體保持很好的穩定性，但是在工藝開上往往容易導致二硫鍵的錯配，如果突變掉以后，抗體就丟失活性。查詢Ablyx的專利，發現Ablyx公開的序列中未發現兩對二硫鍵的序列。Camel，Alpaca，llama 在額外二硫鍵的位置與豐度上有很大的不同。
Camel 前面已經介紹了血清單域抗體含量高，且抗體Germline更豐富，但是除了IGHV3S42以外，剩下32條都含有額外二硫鍵，其中IGHV3S43~ IGHV3S71 二硫鍵的位置在CDR1~CDR3，IGHV3S72~ IGHV3S474二硫鍵的位置在FR2的50位氨基酸~CDR3.采用NGS 分析NBbiolab的Phage & Yeast display based Na?ve VHH libraries from Camelus bactrianus，發現85%以上的序列都含有兩對二硫鍵。
Alpaca 17條Germline中，有8條含有兩對二硫鍵，額外二硫鍵的位置在55位與CDR3之間，采用NGS 分析NBbiolab的Phage display based Na?ve VHH libraries from Alpaca，發現32%的序列有兩對二硫鍵。
Llama 5條Germline中，3條有兩對二硫鍵，額外二硫鍵的位置在55位與CDR3之間，采用NGS 分析NBbiolab的Phage display based Na?ve VHH libraries from llama，發現22.3%的序列有兩對二硫鍵，與文獻中報道的llama是這三個物種血清中二硫鍵最低的一致。
納米抗體與human VH同源性
Camel VHH與human VH同源性在67.5%~74.3%之間，而Alpaca，llama與human VH的同源性在80%~87.3%之間。
納米抗體分類
VHH 屬于Ⅲ族家系3，其至少可以再細分為 4 個亞家系 VHH1~VHH4。通常，高變區主鏈經常呈現的構象稱為規范結構（canonical structure），VHH 中 CDR1 與 CDR2 的主鏈規范結構與傳統的明顯不同；而且，不同的 VHH 亞家系有不同的 CDR1 和CDR2 規范結構。
VHH1 和 VHH2 的 CDR3 長度較短，沒有超過傳統 VH的 CDR3 平均長度，但仍然保持高度的可溶性、穩定性和結合抗原的功能性；只有VHH3 和 VHH4 的 CDR3較長，氨基酸殘基數達到16~24個，遠遠超過傳統VH的 7~9 個氨基酸殘基的數量，形成的指狀凸環能嵌入抗原分子溝槽或裂隙內，增大與抗原相互作用的面積。
VHH3主要存在于羊駝中，一般在FR2與CDR3有一對額外的二硫鍵;；VHH4主要存在于駱駝中，在CDR1與CDR3之間形成一對額外的二硫鍵(85%)且11位的亮氨酸（L）變為了絲氨酸（S）。
VHH各亞家系中FR1和FR3的氨基酸序列彼此同源，且均與人或小鼠VH Ⅲ族的家系3同源。
