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      酵母表面展示技術平臺快速、高通量的發現納米抗體

      簡介

      酵母表面展示技術是一套應用于抗體發現、靶點發現及蛋白工程領域的通用技術。


      在抗體工程中,利用酵母真核表達系統的特性,將抗體文庫蛋白表達于酵母細胞表面,利用磁珠和流式細胞分選技術進行篩選,獲得高親和力或高穩定性的抗體序列。此項技術在各種骨架形式的抗體工程,如單鏈可變區scFv、抗體結合區片段Fab、全長IgG、駱駝科單域抗體可變區VHH,以及抗體親和力成熟、抗體穩定性提升、pH穩定性等方面均有廣泛應用。NBbiolab建立了成熟穩定的yeast display平臺,能夠方便且快速的發現納米抗體。


      原理

      目前雖然已實現了多種酵母細胞株及多種細胞壁錨定點用來展示各種蛋白,但最常用的還是釀酒酵母α-凝集素。


      α-凝集素由2個核心亞單位Aga1和Aga2組成。在該系統中,編碼Aga1蛋白的基因穩定地整合到酵母染色體中,而將編碼蛋白支架-Aga2融合蛋白的基因克隆到環狀酵母展示質粒載體中,該質粒載體使用營養標記物選擇性地維持在酵母中。誘導蛋白表達后,蛋白質支架表達為與Aga2蛋白的融合體,融合體Aga2蛋白再通過兩個二硫鍵與α-凝集素Aga1蛋白共價連接形成共價復合物,并分泌至酵母細胞表面(圖1)。Aga1和Aga2的表達均受半乳糖誘導型啟動子的控制。由于表面展示是有條件的,而不是組成性的,因此可以表達潛在的細胞毒性蛋白支架,從而避免了由于這種支架的負選擇而造成的文庫偏倚。每個酵母細胞大約可以展示5萬個蛋白-Aga2融合物,展示水平可能低或高取決于蛋白質支架的穩定性和溶解度。

      Yeast display 原理與流程

      圖1Yeast display 原理與流程


      對于酵母文庫篩選,我們通常經驗是采用流式細胞分選法或磁珠篩選結合流式分選的方法。免疫文庫通常僅需1輪磁珠篩選結合1-2輪流式細胞分選,通過NGS測序就可獲得多株多樣性豐富且親和力高的抗體序列,進一步對多個克隆進行鑒定,之后還可按要求進行多輪親和力成熟提高性能。


      技術優勢

      Yeast display 與 Phage display 相比,酵母表面展示具有以下顯著優勢:


      1、 酵母具有類似于高等真核生物的分泌途徑, 蛋白質折疊在內質網中,其中伴侶蛋白,折疊酶和質量控制機制確保僅分泌正確折疊的蛋白質。而噬菌體是原核系統,有些抗體對大腸桿菌有毒的克隆,其生長緩慢甚至不生長,導致文庫的偏向與克隆的丟失。


      2、通過噬菌體展示篩選更高親和力的抗體時,通常會受到篩選處理過程的不利影響,不僅取決于親和力,還取決于抗體表達水平。而酵母展示系統采用FACS分選技術,基于抗體親和力及展示水平進行篩選,因此消除了表達引起的偏差,且能區分相差很小親和力的克隆。


      3、酵母展示是多價展示,能夠一次通過Sorting直接分選高,中&低親和力的克隆,非常方便。


      4、通過使用雙染色的 FACS,可以直接在酵母細胞表面上確定抗體親和力,從而無需耗時的亞克隆、表達和純化。


      5、抗體篩選速度快,3min即可完成10萬個細胞的分選,獲得100+的unique sequence 候選克隆。


      6、在相同的展示系統下可對抗體的親和力和穩定性進行優化。


      案例分享---NB154項目


      1.羊駝免疫及血清檢測

      NB154項目抗原免疫四次Alpaca,每次間隔21天,三次boost后血清titer穩定,達到了128K。

      Dilution Folds

      2.構建酵母文庫

      分別采集A羊駝的三免及四免之后50mL外周血,分離PBMC。用RNAiso Plus試劑提取總RNA,取1μg RNA電泳,檢測RNA純度。


      NB154 RNA電泳圖

      圖3 NB154 RNA電泳圖(A:三免后提取A羊駝總RNA;B:四免后提取A羊駝總RNA)


      采用巢式PCR的方法,將VHH構建到酵母載體中,庫容量為:1.2×108個。


      庫容量測定

      圖4 庫容量測定(左:10-5轉化子計數平板;右:10-6轉化子計數平板)


      隨機從文庫平板上挑取48個單克隆進行PCR鑒定,結果表明插入率為100%,測序結果表明無重復,多樣性良好。

      文庫插入率檢測

                                          圖5 文庫插入率檢測


      3.文庫篩選與鑒定

      第一輪采用磁珠進行富集:

      磁珠1輪篩選產物染色后流式儀分析圖譜見圖6。

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      圖6 磁珠1輪產物流式儀分析圖譜(左:細胞密度圖;右:柱狀圖,黃色為未染色對照細胞,紅色為樣品染色細胞)


      第二輪采用流式分選儀分選結果(儀器Sony SH800s)。

      流式分選儀分選圖譜見圖7,分選得到105個細胞。

      image.png

                   圖7 流式分選儀分選圖譜(設置O門為分選細胞群)


      從圖我們可以清晰的看出,抗體親和力分為高中低三群,根據客戶要求選擇高與中親和力抗體群進行分選,分選到96孔板中并采用流式分析儀(sony SA3800)進行單克隆鑒定。將隨機選擇192個陽性克隆送測序進行鑒定,共獲得52條unique sequences。

      克隆流式鑒定

      克隆流式鑒定

                                                                           圖8.部分克隆流式鑒定結果


      文獻報道的酵母表面展示應用案例

      應用案例


      酵母展示納米抗體發現服務:

      基于NBbiolab成熟的酵母展示納米抗體研發平臺,我們提供以下服務,歡迎咨詢~

      Yeast Display Library Construction Service

      Yeast Display Library Screening Service


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