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        Nanodisc 在 GPCR 抗體研發中的應用

        一、GPCR簡介


        GPCR( Guanosine-binding Protein Coupled Receptor)中文名稱為G蛋白偶聯受體,是一種膜蛋白受體。GPCR作為細胞信號傳導中的重要蛋白,其共同點是其蛋白體結構中都有七個跨膜結構。研究顯示GPCR參與了很多細胞信號轉導過程,當膜外的配體作用于該受體時,該受體的膜內部分與G蛋白發生結合,從而激活G蛋白。G蛋白可通過兩種途徑傳遞細胞外的信息:第一種方式是打開跨膜離子通道,讓外界的離子進入;第二種方式是激活第二信使,如:cAMp、IP3/DAG等。簡單來講,GPCR能結合細胞周圍環境中的化學物質并激活細胞內的一系列信號通路,最終引起細胞狀態和功能的改變,同時參與多種生命活動以及內分泌與代謝等多種生理過程。從疾病方面來看,GPCR也與糖尿病、心臟病、腫瘤、免疫疾病等重要疾病的發生、發展及治療密切相關。

        隨著科研和生物醫藥領域發展的不斷深入,GPCR的重要性也愈發顯現,為了表彰在這一領域的貢獻,2012年諾貝爾化學獎授予了兩位美國科學家:羅伯特·萊夫科維茨(Robert J. Lefkowitz)和布萊恩·科比爾卡(Brian K. Kobilka),他們因“G蛋白偶聯受體”研究領域的杰出貢獻而獲獎。從生物醫療領域的數據來看,大約40%的現代藥物都以GPCR作為靶點。而至少有三分之一的小分子藥物是GPCR的激活劑或者拮抗劑,在暢銷藥物排行中就有眾多藥物屬于GPCR相關藥物,比如:充血性心力衰竭藥物Coreg、高血壓藥物Cozaar、乳腺癌藥物Zoladex等,而還有更多這樣的候選藥物小分子在臨床研發中。

        針對GPCR的分類,主流有兩種方法:一是A-F分類系統,面向所有生物體內的GPCR蛋白;第二種是將GPCR蛋白被分為Glutamate、Rhodopsin、Adhesion、Secretin、Frizzled/TAS2這5類。按照第二種分類標準來看,Rhodopsin受體類是GPCR家族中最大的一類,而其下還分為多種亞家族。而整個Rhodopsin家族包含各種重要受體,如組胺受體、多巴胺受體、大麻素受體、內皮素受體、催產素受體等。而其它類GPCR也包含眾多受體種類,如鈣敏感受體、甜味味覺受體等。

        二、GPRC單抗藥物開發


        現階段,作為開發藥物靶點的受體約370個,分布于Glutamate、Rhodopsin、Adhesion、Secretin、Frizzled/TAS2 五大家族內。這些GPCR主要與生理代謝和疾病的形成有關,包括癌癥、炎癥、感染、代謝疾病等。藥物作用于GPCR靶點,其主要的作用是阻斷或激活胞外信號對靶點的激活,調控由靶點介導的胞內信號傳導以及阻斷病毒通過靶點侵入。作用于GPCR受體的藥物可以是小分子藥物或抗體類藥物,相對于小分子藥物,單克隆抗體藥物治療GPCR相關疾病擁有多方面優勢??贵w在體內的清除率更低,作用時間更長;并且在給定劑量下,抗體的血漿濃度的個體差異更小。另一方面在藥物開發方面,對于一些受體,小分子藥物通過高通量篩選階段的陽性率很低,成藥難度大。此外單抗藥物可以具有對受體更高的特異性以及避免一些小分子要會帶來的副作用,如小分子藥物可以穿過血腦屏障引起藥副作用?,F針對GPCR受體,用于治療癌癥、炎癥和感染的很多抗體藥物已經進入臨床或上市,而更多的其它抗體藥物正在加緊研發的過程中。
         
        三、GPCR靶點的抗體藥物研發中需要解決的抗體制備相關問題



        現GPCR抗原主要形式有: GPCR全長蛋白、合成的GPCR胞外N端或loop區域、帶有膜蛋白的細胞膜碎片、過表達GPCR的細胞、帶有GPCR的脂質體、帶有GPCR的類病毒顆粒等。各種方法各有特點,現就其存在的問題做一個簡單描述。



        全長GPCR作為抗原的優勢在于比較純凈且相對接近天然構象,但困難在于獲得了全長蛋白后其原包裹在細胞膜內的疏水域也暴露在外,這樣容易篩到結合跨膜區的抗體。同時由于疏水域暴露在外,蛋白也容易發生聚集影響正確抗體的形成。對于合成胞外N端或loop區制作抗原的方法相對簡單,但它們可能無法模擬蛋白的全部天然構象,表位容易遺漏和失真。帶有膜蛋白的細胞膜碎片和過表達GPCR的細胞由于目標GPCR在整個膜上含量比例很低,因此會給篩選帶來很高的背景從而影響最后結果。脂質體和類病毒顆粒作為GPCR蛋白的載體可以有效降低篩選背景,是現在效果較好的方法之一,但由于脂質體的不穩定性,導致在在應用時有無法忽視的局限。


         篩選方法分為體內免疫和展示篩選。其中體內免疫法是最為常用和經典的方法之一,通過用抗原免疫動物,然后從動物的脾臟中分離B細胞,制備雜交瘤,篩選單克隆抗體。而是否能更好的得到產生目標抗體的B細胞,用與引起免疫反應的抗原的穩定性、單一性、期望產生抗體結合的位點是否外露、不期望產生抗體結合的部分是否被包裹都顯得尤為重要。


        四、Nanodisc用于GPCR抗體的制備


        Nanodiscs是由膜支架蛋白(membrane scaffold proteins, MSPs)和磷脂分子構成的磷脂雙分子層類膜結構。通過這種特殊的結構,GPCR可以整合到Nanodiscs中,保持其生物學活性,為GPCG的研究提供了有力的技術支持。膜支架蛋白(MSPs)是載脂蛋白(apo) A-I的縮減版,它們包繞著脂質雙分子層從而形成圓盤狀的結構,即納米盤。其包含一個朝向內部脂層的疏水面和朝外的親水面。這一結構使得Nanodiscs在水溶液中具有很高的溶解度,同時具有非常高的穩定性。通過Nanodisc包裹,純化后的GPCG在保持空間結構穩定和活性的同時,也將不期望暴露的跨膜域如同在細胞膜內一樣包埋在磷脂雙分子層內部。


        圖2:膜蛋白組裝到Nanodiscs的原理圖.

        綠色:膜支架蛋白(MSPs);灰色:磷脂;橙色:膜蛋白



        五、Nanodisc包裹純化后的GPCR用于抗原制備有眾多優勢


        1、Nanodisc可以為GPCR提供一個類似細胞膜雙分子層的結構,使其原有的結構和功能可以被保護。同時跨膜區域和膜外區域也能和在細胞膜上一致,避免了直接使用純GPCR作為抗體會產生的結合跨膜區域的抗體形成的問題。同時,通過Nanodisc包裹的GPCR作為抗原也避免的直接使用細胞膜碎片作為抗體會引起高背景等問題,使后續篩選難度大大降低。


        2、Nanodisc 包裹完整GPCR,不會有使用合成胞外N端或loop區制作抗原造成的表位容易遺漏和失真的問題。


        3、Nanodisc通過膜支架蛋白固定磷脂,使其結構非常穩定,從而避免了使用脂質體包裹GPCR作為抗原的不穩定和易破裂等問題。


        4、為了針對不同的應用要求,膜支架蛋白可以是人源化或鼠源化的,如此可以避免用鼠作為免疫動物,人源化的膜支架蛋白會引起不必要的免疫反應。


        六、將膜蛋白組裝到Nanodiscs中的兩種方法


        方法1:組裝溶解在去污劑中的膜蛋白

        在去污劑存在條件下將GPCR純化,然后再添加MSPs和磷脂。含有膜蛋白的Nanodiscs能夠自發地組裝,在去除掉表面活性劑后可以通過凝膠過濾(排阻層析)等方式來純化。


        方法2:Nanodiscs與無細胞表達體系相結合

        另一個方法是,GPCR在無細胞表達體系中被表達,通過加入已經和GPCR結合預先組裝的Nanodiscs,膜蛋白能通過無細胞表達系統表達出來。


        圖3:膜蛋白與Nanodisc的兩種組裝機制

        左圖:膜蛋白(橙色)溶解在去污劑(深灰色)中并與凍干的MSP(綠色)和磷脂(淺灰)混合。然后去除去污劑,形成蛋白-Nanodisc復合物。

        右圖:預組裝了MSP與磷脂的Nanodiscs加入到無細胞反應液(cell-free expression systems)中,新生的GPCR能夠自發地組裝到Nanodiscs中。


        GPCR作為藥物靶點在未來有著巨大的潛力,隨著單克隆抗體研發相關技術和產品的豐富,在可見的未來將會有越來越多針對各類疾病的優秀藥物產品推向市場!


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