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        納米抗體在小分子檢測中的應用

        前一期給大家介紹了納米抗體在新一代親和配基中應用,這一期給大家聊聊納米抗體在小分子半抗原檢測中的應用,主要的目的還是給大家經驗分享,特別抗原合成及篩選的方法。


        1.納米抗體在小分子檢測中的優勢


        小分子主要是指分子量小于1000Da的物質,本文主要討論生理激素、農獸藥殘留、真菌毒素等。小分子因分子質量小、抗原表位單一,不能夠同時結合兩個抗體,目前免疫學分析方法多為競爭型。與傳統的單克隆抗體,多克隆抗體相比,納米抗體主要有以下優勢:


        1)納米抗體更穩定——納米抗體因其獨特的結構賦予了自身的熱穩定,因此可大大延長試劑的貨架期。將 5 種OTA(赭曲霉毒素)抗體分別在25、 50、 65、 80、 95 ℃孵育 5 min,待溫度降至室溫后,測定 5 種抗體的抗原結合能力,結果如下圖所示, McAb 6H8 在 80 ℃加熱 5 min 完全失活,而四種納米抗體在 95 ℃加熱 5 min后,仍至少保留了約 50%的抗原結合能力,其中又以 Nb32 和 Nb36 的熱穩定性最高。其次評估不同處理時間對抗體活性的影響,將 5 種抗體在 90 ℃分別孵育0、 5、 15、 30、 45、 60、 75 min,待溫度降至室溫后,測定 5 種抗體的抗原結合能力,結果如圖所示, McAb 6H8 在 90 ℃加熱 5 min 后完全失活,而四種納米抗體在 90 ℃加熱 60 min 后,仍至少保留了約 25%的抗原結合能力。



        2)能夠容忍高有機溶劑——對于脂溶性的小分子來說,在提取過程中需要加入有機溶劑如甲醇,DMSO,乙酸等來提取,含有機溶劑的提取液,會在檢測中引起基質干擾。雖然基質干擾可以通過稀釋來消除,但是這會導致需要更高靈敏度的抗體。納米抗體相對于傳統單克隆抗體相比,具有更高耐有機溶劑的能力,如針對脂溶性的真菌毒素---黃曲霉毒素B1(AFB1)的納米抗體Nb26與Nb28,在70%的甲醇條件下仍然具有抗體活性。




        Effects of MeOH on the performance of the nanobodies Nb26-based ELISA (A) and Nb28-based ELISA (B). PBS buffers containing methanol at different concentrations, 10%, 20%, 40%, 60%, and 70%, were used to make serial dilutions of free AFB1. The serial dilutions were mixed with equal volumes of nanobodies Nb26 and Nb28, and then 100 μL of the mixture was added into wells. The bound immunoreagents were detected by adding 100 μL of HRP conjugated anti HA-tag mAb for nanobody (1/10 000 dilution in PBS). Values are the mean ± standard deviation of three well replicates.


        3)納米抗體進行非常方便的基因操作——雙價,多價納米抗體提高親和力;加入各種標簽以方便各種檢測應用,如直接通過與AP酶融合表達,可縮短檢測時間,降低了通過化學偶聯AP酶而導致的披肩差異。


        4)表達純化方便,能夠降低原料成本——納米抗體可以非常方便在大腸桿菌中和酵母中進行發酵表達,因此制備成本低廉。


        很多文獻中提到因納米抗體CDR3較長,一般用來識別構象表位,我們在文獻中很少見到用納米抗體來做WB實驗。因此針對小分子納米抗體開發難度比較大,那如何才能提高成功率與降低項目開發成本呢?




        2.抗原準備


        小分子物質本身不具有免疫原性,因此建立小分子免疫學檢測方法的關鍵是全抗原的合成,其結果直接影響能否獲得納米抗體。目前,小分子物質全抗原的合成主要通過人工化學合成的方法將活化的小分子與載體蛋白進行偶聯,這個過程中需要考慮很多問題,就個人經驗與大家交流,因本人知識有限,如果有錯誤,還請大家批評指正:


        1.如果待測物本身含有NH2,COOH,OH等活性基團,可以利用待測物活性基團加入間隔臂,然后聯入載體蛋白就可以成功合成人工抗原,制備特異性良好的抗體。但大部分待測物上并不含有活性基團或活性基團對小分子活性影響很大,就需要對小分子半抗原進行改造,來引入活性基團或從頭合成。


        2.如果待測物結構過于簡單,可能也是不能建立免疫檢測方法的。待測物的結構最好含有特征性的環狀結構或側鏈結構,甚至含有雜原子,都能夠增加制備出高質量抗體的可能性。簡單的直鏈結構很難產生特異性很強的抗體,這也是一般選用直鏈作為間隔臂的原因。


        3.小分子在與載體蛋白連接的部位很容易受到屏蔽,從而產生的抗體就會喪失對那些屏蔽基團的特異性。確定半抗原不受蛋白的屏蔽作用在人工抗原合成中非常重要,解決這一問題的最佳方法就是聯入間隔臂。


        4. 間隔臂的連接位點的選擇,最好不要影響小分子化合物中特征性的基團暴露于免疫B細胞的抗原表位,這也是待測物本身的羧基,氨基一般不能直接聯入間隔臂,因為這些基團對小分子藥物的電性和極性影響非常大。而且引入的間隔臂不能影響主要基團的電子分布,例如苯環和其他雜環類的電子分布,這就要求間隔臂的極性和能量要低,將對小分子藥物的電子排布和空間結構的影響降到最低,從這個角度來說,低能量的直鏈間隔臂是最佳的選擇。聯入間隔臂的半抗原的電子分布與目標待測物的電子特性一致性對抗體針對待測物的特異性至關重要。


        5.半抗原間隔臂的連接位點,最好選擇極性較低且遠離半抗原的特征性結構。如果待測物的極性較高,半抗原合成的過程中最好保持其與目標待測物極性的一致性。人工抗原具有較高的極性,對于引發免疫反應有重要作用。


        6.間隔臂引入不要太長,一般3~6個直連碳原子,太長會導致半抗原分子的折疊,使其更接近載體蛋白,屏蔽作用增強。


        7.一般認為,用與免疫動物親緣關系較遠的蛋白作為載體可能會更好,KLH,BSA與HSA都是良好的載體蛋白,均能刺激動物產生特異性抗體。

        在制備全抗原的過程中,需要同時準備兩種不同載體蛋白的抗原,一種用于免疫,一種用于納米抗體篩選及檢測。


        3.血清檢測



        經過三至四次免疫,采集羊駝頸靜脈全血,檢測血清,如果能與待測物形成競爭抑制,且IC50達到ng級,基本上算成功了大半。如果不能,項目就可以終止了。但在實驗過程中,我們也發現雖然血清與待測物能夠形成競爭抑制實驗,但是我們并未篩選到合適的納米抗體。我們將血清純化分型發現,血清中只有IgG1能夠待測物形成競爭抑制,而IgG2,IgG3均不能與待測物形成競爭抑制。因此我們所有針對小分子納米抗體項目,在免疫后都采用檢測IgG2與IgG3。



        4.篩選方法


        在構建完納米抗體文庫后,如何才能篩選到我們想要的高親和力,高特異的納米抗體呢?


        1)抗原呈遞

        小分子篩選抗原的載體一般是BSA 或者OVA,呈遞我們基本采用固相篩選呈遞的方式,直接通過物理吸附固定于酶標板孔,非常方便。封閉液采用兩種不同的無相關性的蛋白進行封閉如BSA,OVA,脫脂奶粉等。


        2)選擇壓

        篩選過程中選擇壓的控制非常重要,一般是通過控制包被抗原濃度,洗滌強度,競爭洗脫中控制小分子的濃度來篩選到高親和力的納米抗體。第一輪的篩選目的是為了從文庫中盡可能多的捕獲陽性克隆,同時去除無功能性展示的噬菌體殘余。應該用多孔的包被后的靶標與大量的可溶性靶標,來確保大量的捕獲結合后的噬菌體,以保持文庫的多樣性。在隨后的幾輪篩選中,選擇壓應該隨著富集度的提高而提高,如提高洗滌次數,時間,降低包被濃度等。


        3)洗脫

        我們常見的有兩種方法,一是酸洗脫,二是競爭洗脫。在小分子抗體篩選過程中,競爭洗脫基本上是使用最多的,效果也是最好的。目前有兩種觀點,一種是競爭洗脫液中待檢小分子的濃度應該從高到底,另外一種恰恰相反,小分子的濃度應該從低到高。文獻中報道的競爭洗脫基本都以第一種方法為主。


        5.應用舉例


        隨著科研學者對納米抗體的深入認識,其在食品有害物質的檢測分析、植物抗病蟲害等食品安全領域的研究與應用得到廣泛重視。 由于納米抗體具有較強的抗原識別能力,可用于真菌毒素或農藥殘留等有毒小分子化合物的免疫學檢測。美國 UC Davis分校的Bruce D hammock教授課題組在應用納米抗體檢測農藥殘留領域可算是首屈一指,國內小分子納米抗體研究最早是南昌大學許楊教授課題組,主要研究針對真菌毒素的納米抗體。下表總結了近些年納米抗體在小分子檢測領域的研究進展。



         通過免疫羊駝使得特異性納米抗體在動物體內經過親和成熟并富集,因而較易從構建的納米抗體文庫中篩選得到親和力好的納米抗體,相比之下,通過非免疫庫則較難篩選到針對小分子的高親和力的納米抗體。

         


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